如果懷疑猴痘，衛生工作者應採集適當的樣本並將其安全運送到具備適當能力的實驗室。猴痘的確認取決於標本的類型和質量以及實驗室檢測的類型。因此，標本應按照國家和國際要求進行包裝和運輸。鑒於其準確性和敏感性，聚合酶鏈式反應 (pcr) 是首選的實驗室測試。為此，猴痘的最佳診斷樣本來自皮膚病變——囊泡和膿皰的頂部或液體，以及乾燥的結痂。在可行的情況下，活檢是一種選擇。病變樣本必須儲存在乾燥、無菌的試管中（無病毒運輸介質）並保持低溫。
由於正痘病毒具有血清學交叉反應性，抗原和抗體檢測方法不能提供猴痘特異性確認。因此，不建議將血清學和抗原檢測方法用於資源有限的診斷或病例調查。此外，最近或遠程接種基於牛痘的疫苗（例如，在根除天花之前接種過疫苗的任何人，或由於高風險而最近接種過疫苗的人，例如正痘病毒實驗室人員）可能會導致假陽性結果。
為了解釋測試結果，提供患者信息和樣本至關重要，包括：a) 發熱日期，b) 皮疹發作日期，c) 樣本採集日期，d) 個體當前狀態（皮疹階段），和 e) 年齡。