[摘要]目的探討年齡相關性聽力損失對小鼠學習記憶能力的影響。方法取4周齡昆明小鼠14隻，隨機分為對照組和模型組，模型組小鼠每日腹腔注射150mg/（kg·d）的d-半乳糖誘導年齡相關性聽力損失（arhl）模型，對照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，持續2個月。分別於注射前及注射後1個月和2個月，檢測小鼠聽力的損害。聽腦幹反應（abr）檢測小鼠聽覺功能，morris水迷宮實驗檢測小鼠學習以及能力。結果造模2個月後模型組小鼠abr閾值顯著升高，並且與對照組相比，存在顯著性差異（p<0.01），arhl小鼠模型造模成功。arhl小鼠潛伏期和上台前路程均顯著長於對照組（p<0.05），並且在目標象限游泳時間和穿越平台次數也顯著減少（p<0.05）。結論年齡相關性聽力損失模型小鼠學習和記憶能力下降，記憶保持能力也有所下降。
[關鍵詞]年齡相關性聽力損失;學習記憶能力;聽腦幹反應;morris水迷宮。
[中圖分類號]r392 [文獻標識碼]a [文章編號]1673-9701（2019）05-0031-03。
[abstract]objectivetoinvestigatetheeffectofage-relatedhearinglossonlearningandmemoryabilityinmice.methods14kunmingmiceof4weeksoldwererandomlydividedintocontrolgroupandmodelgroup.themiceinthemodelgroupwereintraperitoneallyinjectedwith150mg/（kg·d）d-galactosetoinduceage-relatedhearingloss（arhl）model.thecontrolgroupwasintraperitoneallyinjectedwiththesamedoseofnormalsalinefor2months.thehearingimpairmentofthemicewastestedbeforeinjectionandat1monthand2monthsafterinjection，respectively.theauditorybrainstemresponse（abr）wasusedtodetecttheauditoryfunctionofmice，andthemorriswatermazetestwasusedtodetectthelearningandabilityofmice.resultsafter2monthsofmodeling，theabrthresholdofthemodelgroupwassignificantlyincreased，andtherewasasignificantdifferencebetweenthemodelgroupandthecontrolgroup（p<0.01）.thearhlmousemodelwassuccessfullymodeled.thelatencyandthepre-stationarypathofarhlmiceweresignificantlylongerthanthatofthecontrolgroup（p<0.05），andtheswimmingtimeandthenumberofcrossingplatformsinthetargetquadrantwerealsosignificantlydecreasedinthearhlmice（p<0.05）.conclusiontheage-relatedhearinglossmodelmicehavedecreasedlearning，memoryabilityandmemoryretention
[keywords]age-relatedhearingloss;learningandmemoryability;auditorybrainstemresponse;morriswatermaze
老年性耳聾即年齡相關性聽力損失（age-relatedhearingloss，arhl），是指隨著年齡的增長，聽覺器官發生緩慢的進行性老化，主要表現為高頻聽力下降，並逐漸累及低頻聽力。近年研究發現學者發現[1]，arhi患者數量比以前有明顯增加。並且研究發現在60歲以上人群中，35%～55%患有不同程度的聽力障礙[2]，而相關研究預測至2050年60歲以上人口將達4.91億，因此arhi患者數量巨大，越來越受到人們的關注[3]。2014年franklin等的研究顯示聽力損失與痴呆、抑鬱、平衡失調和跌倒風險的增加相關，且發生痴呆的風險隨著基線聽力損失的嚴重程度線性增加（每10db聽力損失風險增加1.27倍）[4，5]。taljaard和olaithe於2016年發布了一項由5534名聽力損失患者參與的大型meta分析顯示聽力受損程度與一般認知之間的劑量-反應關係，且聽力治療可以改善認知功能[6]。但是關於年齡相關性聽力損失對小鼠學習記憶能力影響的研究較少，因此本研究對半乳糖衰老模型大鼠進行研究，明確年齡相關性聽力損失對小鼠學習記憶能力的影響。1材料與方法。
1.1動物模型建立[7，8]
取4周齡昆明小鼠14隻，隨機分為對照組和模型組，模型組小鼠每日腹腔注射150mg/（kg·d）的d-半乳糖誘導老年性耳聾模型，對照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，持續2個月。分別於注射前及注射後1個月和2個月，檢測小鼠聽力的損害。本研究通過倫理委員會批准。
1.2聽腦幹反應（abr）檢測小鼠聽覺功能[9]
聽腦幹反應檢測在隔音屏蔽室內進行。小鼠用1%戊巴比妥鈉90mg/kg經腹腔注射麻醉後，將電極的正極置於動物顱頂正中皮下，負極置於給聲側耳廓後下方，接地電極置於對側耳廓後下方，屏蔽耳機距測試小鼠外耳道口0.5cm。應用美國智聽公司smartep&oae聽覺誘發電位-耳聲發射記錄系統給予短純音刺激，選取8khz、12khz、24khz3個頻率分別進行測試並記錄。重複率39.1次/s，帶通濾波100～300hz，疊加1024次，掃描時程16.0ms。聲刺激強度從95dbspl開始，以5db逐次遞減，聽閾判定以剛出現abrⅠ波為準並至少重複2次。
1.3morris水迷宮實驗[10]
選擇安靜、暗光、恆溫環境進行測試。實驗前將水桶灌以清水至預定高度（約40cm），再加入適量白色素，使水成為不透明的乳白色液體，加熱器加熱水溫至25℃。平台置於第四象限中央，位於水面以下約1.5cm。訓練期依次從4個入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠尋找並爬上平台所需時間，即逃避潛伏期，停留30s進行下一方向的訓練。如果120s內未找到平台，由實驗者將其引至平台，並在平台上停留30s後進行下一方向訓練。定位航行實驗用於評價動物學習和記憶能力。前3d為動物訓練期，第4天，依次從第一、二、三象限入水點將小鼠面向池壁放入水中，分別記錄小鼠第1天、第2天、第3天和第4天在水中逃避潛伏期和上台前路程。空間搜索實驗用於評價動物平台位置的記憶，即記憶保持能力。第5天撤除平台，依次從第一、二、三象限入水點將小鼠面向池壁放入水中，分別3次記錄小鼠90s內在目標象限游泳時間和穿越平台次數。
1.4統計學方法
數據採用統計學軟體spss18.0進行處理和分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較採用獨立樣本t檢驗，p<0.05為差異具有統計學意義。
2結果
2.1abr檢測結果。
注射前經過不同頻率刺激，對照組和模型組小鼠abr閾值沒有顯著性差異（p>0.05）;注射造模後1個月，對照組小鼠abr閾值沒有顯著變化（p>0.05），而模型組小鼠abr閾值顯著升高（p<0.05），與對照組相比，模型組小鼠abr閾值顯著高於對照組，差異有統計學意義（p<0.05）;注射造模後2個月，對照組小鼠abr閾值沒有顯著變化（p>0.05），而模型組小鼠abr閾值顯著升高（p<0.01），與對照組相比，模型組小鼠abr閾值顯著高於對照組，差異有統計學意義（p<0.01），見表1。造模後模型組小鼠abr閾值變化穩定，造模成功。
2.2兩組morris水迷宮定位航行實驗結果。
morris水迷宮定位航行實驗結果顯示，模型組小鼠潛伏期明顯長於對照組（p<0.05）;並且上台前路程也顯著長於對照組（p<0.05），見表2。結果證實年齡相關性聽力損失模型小鼠學習和記憶能力下降。
2.3兩組morris水迷宮空間探索實驗結果。
空間探索實驗結果發現，模型組小鼠在目標象限游泳時間比對照組顯著減少（p<0.05），並且模型組小鼠穿越平台次數也顯著減少（p<0.05），見表3。結果證實年齡相關性聽力損失模型小鼠記憶保持能力也有所下降。
3討論
隨著我國老齡化社會的到來，老年性耳聾的患病率大幅上升，據不完全統計，2017年已達到5000萬，預計到2030年，arhl預計將成為疾病負擔的前15個原因[11]。目前研究發現中、重度聽力損失的老年患者，發生認知功能障礙的幾率比正常老年人顯著升高[12]。同時一項流行病學調查研究也發現聽覺障礙的患者認知功能障礙發病率升高[13]，並且阿爾茨海默病發病風險也增高[14]。另外動物研究也發現，聽力損失模型小鼠認知功能下降，並且研究還發現聽力損失模型小鼠海馬突觸退變明顯，這一變化可能與認知功能下降有關[15]。
半乳糖衰老模型是目前使用較為廣泛的一種人工老化模型，具有衰老變化明顯、模型穩定、耗時短等優點。因此本研究對小鼠進行d-半乳糖注射進行造模，結果發現，造模2個月後模型組小鼠abr閾值顯著升高，並且與對照組相比，存在顯著性差異（p<0.01）。造模後模型組小鼠abr閾值變化穩定，與以往研究結果一致[7，8]，arhl小鼠模型造模成功。同時，本研究應用morris水迷宮結果發現，第1、2、3、4天arhl小鼠學習能力低於對照動物（p<0.05）;隨著學習時間的延長，arhl小鼠潛伏期和上台前路程逐漸縮短，顯示出學習的作用，而第4天arhl小鼠學習能力仍然顯著低於對照組。但在第5天的記憶測試中，arhl小鼠在目標象限游泳時間和穿越平台次數顯著低於對照組（p<0.05），顯示arhl小鼠海馬相關的空間學習能力及空間記憶能力顯著降低。結果證實年齡相關性聽力損失模型小鼠學習和記憶能力下降，記憶保持能力也有所下降。內質網是細胞內蛋白質合成、加工及修飾的場所，大量未摺疊及錯誤摺疊的蛋白質在內質網腔中聚集將會引起內質網應激（endoplasmicreticulumstress，ers）。ers參與誘導內耳毛細胞的凋亡，從而引起聽力損失，也參與神經細胞的凋亡，影響智力發育，這可能是年齡相關性聽力損失可以降低小鼠學習和記憶能力的潛在機制。綜上所述，年齡相關性聽力損失可以降低小鼠學習和記憶能力。因此臨床上針對年齡相關性聽力損失的老年患者要注意加強鍛鍊學習記憶能力，必要時採取適當治療，改善認知功能，延緩阿爾茨海默病的發生。
[參考文獻]。
[1]franeescop，vincenzos，davides，eta1.age-relatedhearingimpairmentandfrailtyinalzheimer[j].frontiersinagingneuroseienee，2015，7（9）：113-119。
[2]莫文權，楊暉，褚文浩，等.中醫綜合療法治療老年感音神經性耳聾的l臨床隨機對照研究[j].上海中醫藥雜誌，2017，51（8）：68-72。
[3]胡傑成.我國人口老齡化現狀、趨勢與建議[j].中國經貿導刊，2017，12（1）：59-62。
[4]linfr，metterej，o』brienrj，etal.hearinglossandincidentdementia[j].archneurol，2011，68（2）：214-220。
[5]linfr，albertm.hearinglossanddementia-whoislistening[j].agingmenthealth，2014，18（6）：671-673。
[6]taljaardds，olaithem.therelationshipbetweenhearingimpairmentandcognitivefunction：ameta-analysisinadults[j].clinotolaryngol，2016，41：718-729。
[7]黃雙.d-半乳糖致小鼠衰老模型劑量和給藥方式探討[d].南寧：廣西醫科大學，2014。
[8]張海靜，王哲，武瑩，等.耳聾左慈丸對老年性耳聾模型小鼠血清sod，mda、pkc的影響[j].中國中醫藥現代遠程教育，2016，14（l）：136-138。
[9]張博，陳穎，黃喜，等.參芎注射液對順鉑致小鼠耳毒性及耳蝸caspase-3表達的影響[j].實用臨床醫藥雜誌，2016，20（23）：1-4。
[10]於亞峰，翟豐，戴春富，等.c57bl/6j小鼠聽力損失與認知功能下降的相關性[j].中華醫學雜誌，2011，91（34）：2430-2434。
[11]matherscd，loncard.projectionsofglobalmortalityandburdenofdiseasefrom2002to2030[j].plosmed，2006，3（11）：e442-446。
[12]davieshr，cadard，herberta，etal.hearingimpairmentandincidentdementia：findingsfromtheenglishlongi-tudinalstudyofageing[j].jamgeriatrsoc，2017，6（22）：1-8。
[13]fischerme，cruickshankskj，schubertcr，etal.age-relatedsensoryimpairmentsandriskofcognitiveimpairment[j].jamgeriatrsoc，2016，64（10）：1981-1987。
[14]gatesga，beisera，reests，etal.centralauditorydysfunctionmayprecedetheonsetofclinicaldementiainpeoplewithprobablealzheimer’sdisease[j].jamgeriatrsoc，2002，50（3）：482-488。
[15]王馳，柳柯，趙立東，等.老年性聾耳蝸帶狀突觸數量在時空上的改變[j].中華耳科學雜誌，2016，14（1）：32-36。
[關鍵詞]年齡相關性聽力損失;學習記憶能力;聽腦幹反應;morris水迷宮。
[中圖分類號]r392 [文獻標識碼]a [文章編號]1673-9701（2019）05-0031-03。
[abstract]objectivetoinvestigatetheeffectofage-relatedhearinglossonlearningandmemoryabilityinmice.methods14kunmingmiceof4weeksoldwererandomlydividedintocontrolgroupandmodelgroup.themiceinthemodelgroupwereintraperitoneallyinjectedwith150mg/（kg·d）d-galactosetoinduceage-relatedhearingloss（arhl）model.thecontrolgroupwasintraperitoneallyinjectedwiththesamedoseofnormalsalinefor2months.thehearingimpairmentofthemicewastestedbeforeinjectionandat1monthand2monthsafterinjection，respectively.theauditorybrainstemresponse（abr）wasusedtodetecttheauditoryfunctionofmice，andthemorriswatermazetestwasusedtodetectthelearningandabilityofmice.resultsafter2monthsofmodeling，theabrthresholdofthemodelgroupwassignificantlyincreased，andtherewasasignificantdifferencebetweenthemodelgroupandthecontrolgroup（p<0.01）.thearhlmousemodelwassuccessfullymodeled.thelatencyandthepre-stationarypathofarhlmiceweresignificantlylongerthanthatofthecontrolgroup（p<0.05），andtheswimmingtimeandthenumberofcrossingplatformsinthetargetquadrantwerealsosignificantlydecreasedinthearhlmice（p<0.05）.conclusiontheage-relatedhearinglossmodelmicehavedecreasedlearning，memoryabilityandmemoryretention
[keywords]age-relatedhearingloss;learningandmemoryability;auditorybrainstemresponse;morriswatermaze
老年性耳聾即年齡相關性聽力損失（age-relatedhearingloss，arhl），是指隨著年齡的增長，聽覺器官發生緩慢的進行性老化，主要表現為高頻聽力下降，並逐漸累及低頻聽力。近年研究發現學者發現[1]，arhi患者數量比以前有明顯增加。並且研究發現在60歲以上人群中，35%～55%患有不同程度的聽力障礙[2]，而相關研究預測至2050年60歲以上人口將達4.91億，因此arhi患者數量巨大，越來越受到人們的關注[3]。2014年franklin等的研究顯示聽力損失與痴呆、抑鬱、平衡失調和跌倒風險的增加相關，且發生痴呆的風險隨著基線聽力損失的嚴重程度線性增加（每10db聽力損失風險增加1.27倍）[4，5]。taljaard和olaithe於2016年發布了一項由5534名聽力損失患者參與的大型meta分析顯示聽力受損程度與一般認知之間的劑量-反應關係，且聽力治療可以改善認知功能[6]。但是關於年齡相關性聽力損失對小鼠學習記憶能力影響的研究較少，因此本研究對半乳糖衰老模型大鼠進行研究，明確年齡相關性聽力損失對小鼠學習記憶能力的影響。1材料與方法。
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1.2聽腦幹反應（abr）檢測小鼠聽覺功能[9]
聽腦幹反應檢測在隔音屏蔽室內進行。小鼠用1%戊巴比妥鈉90mg/kg經腹腔注射麻醉後，將電極的正極置於動物顱頂正中皮下，負極置於給聲側耳廓後下方，接地電極置於對側耳廓後下方，屏蔽耳機距測試小鼠外耳道口0.5cm。應用美國智聽公司smartep&oae聽覺誘發電位-耳聲發射記錄系統給予短純音刺激，選取8khz、12khz、24khz3個頻率分別進行測試並記錄。重複率39.1次/s，帶通濾波100～300hz，疊加1024次，掃描時程16.0ms。聲刺激強度從95dbspl開始，以5db逐次遞減，聽閾判定以剛出現abrⅠ波為準並至少重複2次。
1.3morris水迷宮實驗[10]
選擇安靜、暗光、恆溫環境進行測試。實驗前將水桶灌以清水至預定高度（約40cm），再加入適量白色素，使水成為不透明的乳白色液體，加熱器加熱水溫至25℃。平台置於第四象限中央，位於水面以下約1.5cm。訓練期依次從4個入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠尋找並爬上平台所需時間，即逃避潛伏期，停留30s進行下一方向的訓練。如果120s內未找到平台，由實驗者將其引至平台，並在平台上停留30s後進行下一方向訓練。定位航行實驗用於評價動物學習和記憶能力。前3d為動物訓練期，第4天，依次從第一、二、三象限入水點將小鼠面向池壁放入水中，分別記錄小鼠第1天、第2天、第3天和第4天在水中逃避潛伏期和上台前路程。空間搜索實驗用於評價動物平台位置的記憶，即記憶保持能力。第5天撤除平台，依次從第一、二、三象限入水點將小鼠面向池壁放入水中，分別3次記錄小鼠90s內在目標象限游泳時間和穿越平台次數。
1.4統計學方法
數據採用統計學軟體spss18.0進行處理和分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較採用獨立樣本t檢驗，p<0.05為差異具有統計學意義。
2結果
2.1abr檢測結果。
注射前經過不同頻率刺激，對照組和模型組小鼠abr閾值沒有顯著性差異（p>0.05）;注射造模後1個月，對照組小鼠abr閾值沒有顯著變化（p>0.05），而模型組小鼠abr閾值顯著升高（p<0.05），與對照組相比，模型組小鼠abr閾值顯著高於對照組，差異有統計學意義（p<0.05）;注射造模後2個月，對照組小鼠abr閾值沒有顯著變化（p>0.05），而模型組小鼠abr閾值顯著升高（p<0.01），與對照組相比，模型組小鼠abr閾值顯著高於對照組，差異有統計學意義（p<0.01），見表1。造模後模型組小鼠abr閾值變化穩定，造模成功。
2.2兩組morris水迷宮定位航行實驗結果。
morris水迷宮定位航行實驗結果顯示，模型組小鼠潛伏期明顯長於對照組（p<0.05）;並且上台前路程也顯著長於對照組（p<0.05），見表2。結果證實年齡相關性聽力損失模型小鼠學習和記憶能力下降。
2.3兩組morris水迷宮空間探索實驗結果。
空間探索實驗結果發現，模型組小鼠在目標象限游泳時間比對照組顯著減少（p<0.05），並且模型組小鼠穿越平台次數也顯著減少（p<0.05），見表3。結果證實年齡相關性聽力損失模型小鼠記憶保持能力也有所下降。
3討論
隨著我國老齡化社會的到來，老年性耳聾的患病率大幅上升，據不完全統計，2017年已達到5000萬，預計到2030年，arhl預計將成為疾病負擔的前15個原因[11]。目前研究發現中、重度聽力損失的老年患者，發生認知功能障礙的幾率比正常老年人顯著升高[12]。同時一項流行病學調查研究也發現聽覺障礙的患者認知功能障礙發病率升高[13]，並且阿爾茨海默病發病風險也增高[14]。另外動物研究也發現，聽力損失模型小鼠認知功能下降，並且研究還發現聽力損失模型小鼠海馬突觸退變明顯，這一變化可能與認知功能下降有關[15]。
半乳糖衰老模型是目前使用較為廣泛的一種人工老化模型，具有衰老變化明顯、模型穩定、耗時短等優點。因此本研究對小鼠進行d-半乳糖注射進行造模，結果發現，造模2個月後模型組小鼠abr閾值顯著升高，並且與對照組相比，存在顯著性差異（p<0.01）。造模後模型組小鼠abr閾值變化穩定，與以往研究結果一致[7，8]，arhl小鼠模型造模成功。同時，本研究應用morris水迷宮結果發現，第1、2、3、4天arhl小鼠學習能力低於對照動物（p<0.05）;隨著學習時間的延長，arhl小鼠潛伏期和上台前路程逐漸縮短，顯示出學習的作用，而第4天arhl小鼠學習能力仍然顯著低於對照組。但在第5天的記憶測試中，arhl小鼠在目標象限游泳時間和穿越平台次數顯著低於對照組（p<0.05），顯示arhl小鼠海馬相關的空間學習能力及空間記憶能力顯著降低。結果證實年齡相關性聽力損失模型小鼠學習和記憶能力下降，記憶保持能力也有所下降。內質網是細胞內蛋白質合成、加工及修飾的場所，大量未摺疊及錯誤摺疊的蛋白質在內質網腔中聚集將會引起內質網應激（endoplasmicreticulumstress，ers）。ers參與誘導內耳毛細胞的凋亡，從而引起聽力損失，也參與神經細胞的凋亡，影響智力發育，這可能是年齡相關性聽力損失可以降低小鼠學習和記憶能力的潛在機制。綜上所述，年齡相關性聽力損失可以降低小鼠學習和記憶能力。因此臨床上針對年齡相關性聽力損失的老年患者要注意加強鍛鍊學習記憶能力，必要時採取適當治療，改善認知功能，延緩阿爾茨海默病的發生。
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